近日,中国科学院上海应用物理研究所与清华大学合作,发展了一种新型的离子介导聚合酶链式反应(Ion-Mediated
Polymerase Chain Reaction,
IM-PCR),通过精确调控溶液pH值(即质子和氢氧根离子),可以在室温下完成PCR扩增,相关结果发表于《德国应用化学》(Angew.
Chem. Int. Ed.
)杂志,并申请了美国和国际专利。

分子级别的纳米泵在生物体内发挥着重要的生物学功能,如细胞内外水分子的输运以及离子的输运等。模拟并构建纳米泵及其功能实现是纳米技术领域的重要挑战之一。DNA纳米技术为解决这一挑战性问题提供了可能。上海应物所樊春海团队基于DNA纳米技术发展了三维、动态DNA纳米结构,并对DNA纳米器件以及生物分子的界面可控组装开展了系统的研究(Acc.
Chem. Res
.2010, 43, 631; Acc. Chem. Res. 2014,47,
550)。之前,通过DNA分子自组装发展了刚性的DNA四面体纳米结构并实现了界面可控组装,并实现了基于三维DNA纳米结构界面的电化学生物传感(Adv.
Mater.
2010, 22, 4754;Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54,
2151)。针对纳米泵问题,研究员左小磊通过与樊春海、胡钧等的合作,充分利用DNA纳米结构精确可调的特点,构建了一种质子响应性的动态DNA四面体纳米结构,该纳米结构可根据溶液的pH的变化进行循环往复的结构变化。通过精确界面组装技术将该结构组装到金界面上,他们实现了质子驱动的DNA纳米泵,该纳米泵可用于驱动水分子以及离子的定向运动。这种三维、动态以及有序的界面在生物传感、逻辑器件以及合成生物学中具有重要的应用潜力。

7、
引物:引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L,这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会,但浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15~30个碱基,引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对,末位碱基最好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。引物G
C约占45~55%,碱基应尽量随机分布,避免嘧啶或嘌呤堆积,两引物之间不应有互补链存在,不能与非目的扩增区有同源性。引物浓度的计算可按下面的方法进行:摩尔猝灭系数是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度值。EM可按下式计算:EM=A+G+C+T

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核心提示:标准的PCR反应体系:10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物
各200umol/L引物

PCR是体外通过酶反应合成、高灵敏扩增目标基因片段的一种方法,是最常用的分子生物学技术之一。常规PCR是通过控制溶液温度来实现DNA分子的可逆变复性,从而达到复制扩增的目的。而这种升降温过程通常需要复杂的控温装置并消耗大量能源。从理论上来说,DNA变复性还可以通过酸碱变性来实现,然而如何在不改变溶液体积的情况下精确控制溶液pH值则是一个难题。上海应物所物理生物学研究室樊春海课题组与清华大学化学系刘冬生课题组合作,建立了一种基于微流控的电化学芯片,可以通过电压驱动快速、精确调控溶液pH值,并实现了对DNA分子机器的电驱动控制(Nano
Lett.

2010,10,1393)。基于这一研究基础,上海应物所博士张一和副研究员李茜发现微流控电化学可以有效控制PCR反应体系的pH值,实现了室温下的酸碱驱动的IM-PCR扩增。与传统PCR技术相比,这一新型的集成化IM-PCR技术无需变温过程,所有反应步骤均在室温下进行。这一小型化、低成本、易于集成的PCR新技术有望在生物检测、临床诊断及环境监测中发挥作用。

近期,中国科学院上海应用物理研究所研究人员基于界面精确自组装技术实现了质子驱动的DNA纳米泵。相关结果发表于Adv.
Mater.
(2016,28,DOI: 10.1002/adma.201506407),并被Nature Reviews
Materials
杂志作为研究亮点,以金沙国际平台 ,Pump fiction
为题进行了专题报道(Nature Reviews Materials 2016,
DOI:10.1038/natrevmats.2016.47)。

4、
三磷酸脱氧核苷酸:dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M
NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,一般存储浓度为 10
mmol/L,小量分装,
-20℃冰冻保存。经过两次冷冻-加热循环,会使dNTP降解,储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存,储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上,因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。在PCR反应中,dNTP应为20~200μmol/L。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等,如其中任何一种浓度不同于其它几种时,就会引起错配。高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;低浓度可提高精确性,而反应速度会降低,降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

上海应物所发展出基于酸碱调控的室温PCR新方法

上海应物所在DNA纳米泵研究方面取得进展

6、
模板:PCR反应的模板可以是DNA,也可以是RNA。当用RNA作模板时,需先经过逆转录生成cDNA然后才能进行PCR反应。含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子.
由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA,故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒,最好先用酶将其切开成线性分子。尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格,但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此,建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102
-105
个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般不要求很高,某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热,用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在如:蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等;尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等;二价金属离子的络合剂等;会与Mg2+络合,影响Taq
DNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果,甚至使扩增失败。模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说,100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。.
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标准的PCR反应体系:

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