细菌通过次级代谢产生具有生物活性的抗生素从而清除异己,争夺环境中的资源,那抗生素产生菌如何避免抗生素对自身产生伤害呢?近期,中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室研究员唐功利课题组在高活性天然产物萘啶霉素的生物合成研究过程中,发现了一个分泌型、FAD依赖的氧化还原酶NapU在胞外氧化无活性前体生成具有生物活性的萘啶霉素,随后还可以进一步氧化萘啶霉素使其失活。相关成果近期发表在《美国国家科学院院刊》上(PNAS
2018,115:11232-11237)。

细菌通过次级代谢产生具有生物活性的抗生素从而清除异己,争夺环境中的资源,那抗生素产生菌如何避免抗生素对自身产生伤害呢?近期,中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室研究员唐功利课题组在高活性天然产物萘啶霉素的生物合成研究过程中,发现了一个分泌型、FAD依赖的氧化还原酶NapU在胞外氧化无活性前体生成具有生物活性的萘啶霉素,随后还可以进一步氧化萘啶霉素使其失活。相关成果近期发表在《美国国家科学院院刊》上(PNAS
2018,115:11232-11237)。

微生物对抗生素的抗性是一种古老的自然现象,它的出现远远早于人类对抗生素的使用。临床上使用的抗生素有相当一部分是由微生物发酵产生的,这些微生物需要进化出对应的抗性基因来保护自己免受所产生抗生素的伤害(自抗性)。这些抗性基因在不同微生物间的水平转移导致多药耐药菌、甚至泛耐药菌变得越来越普遍。因此,对抗生素的生物合成与自抗性机制的研究将有助于人们对抗性基因的产生、进化以及转移得到深入的认识和理解。

萘啶霉素属于四氢异喹啉家族天然产物,该家族抗生素因其良好的抗肿瘤和抗菌活性备受研究者们的关注。它们均具有药效官能团——半缩醛胺,其中羟基通过质子化脱水,伴随氮原子给出孤对电子形成亲电性亚胺物种,形成亚胺的碳原子易被鸟嘌呤中的N-2位亲核进攻从而有效地烷基化DNA。

萘啶霉素属于四氢异喹啉家族天然产物,该家族抗生素因其良好的抗肿瘤和抗菌活性备受研究者们的关注。它们均具有药效官能团——半缩醛胺,其中羟基通过质子化脱水,伴随氮原子给出孤对电子形成亲电性亚胺物种,形成亚胺的碳原子易被鸟嘌呤中的N-2位亲核进攻从而有效地烷基化DNA。

中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室的唐功利课题组多年来一直致力于对结构独特、活性显著的复杂天然产物进行生物合成和自抗性机制研究,从酶催化反应的角度理解自然界神奇的化学反应和生理性拮抗的生化/
化学本质,属于典型的有机化学 – 微生物学 – 生物化学
-天然产物药学的交叉学科,对于天然产物药物研究中重点关注新结构的发现、创造和复杂化合物的高效制备均具有重要的推动作用。

基因敲除发现基因napU失活的突变株发酵产生无半缩醛胺羟基的中间体5。体外酶活测试表明NapU能迅速氧化化合物5生成NDM
;而随着反应时间的延长,NDM缓慢地转化为具有酰胺结构的化合物7。通过对野生型萘啶霉素产生菌的发酵产物进行时间梯度监测,发现发酵产物NDM和化合物7的产量变化与体外酶活测试结果一致。以大肠杆菌作为测试菌,发现化合物5和7的活性远远低于NDM。基于这些实验结果,该团队提出这种胞外氧化活化产生抗生素和进一步氧化失活过程可能是产生菌的一种自抗性机制。随后结合突变和标记实验提出了可能的反应机理;通过Western-Blot和蛋白质谱方法对野生型菌株表达的分泌蛋白NapU进行捕捉和定量,质谱成像显示与中间体及产物存在显著时空相关性;而表达NapU的大肠杆菌对NDM显示明显的抗性。该研究揭示了一种原核生物罕见的“胞内药效团失活-前药外泌与成熟-胞外药效团再生-宿主周边活性抗生素浓度调控”复杂而精巧的时空隔离自抗性机制,进一步暗示了链霉菌富含复杂多样的胞外生理与生化。

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以谷田霉素(YTM)和CC-1065为代表的苯并二吡咯生物碱家族抗肿瘤抗生素的生物合成和自抗性机制研究则集中体现了上述思想。该家族的天然产物是一类来源于微生物、含有环丙烷药效团的高活性天然产物,目前包括YTM、CC-1065
和多卡霉素。这些化合物主要是对细胞内的遗传物质 DNA
进行烷基化修饰,从而达到杀死细胞的目的(IC50 为
pM级)。研究表明这类化合物是靶向治疗中理想的“弹头”,例如,由多卡霉素衍生的抗体药物偶联分子
MDX-1203已进入临床一期,主要治疗非霍奇金淋巴瘤和肾细胞癌。唐功利课题组前期克隆了
YTM(J. Am. Chem. Soc., 2012, 134,8831)和 CC-1065(ACS Chem. Biol.,
2017, 12, 1603)的生物合成基因簇,并发现 DNA 糖苷酶YtkR2 可以将由 YTM
烷基化引起的损伤碱基移除,从而开启 DNA 的一系列修复机制(Angew. Chem.
Int.Ed.,2012, 51, 10532)。

上述成果主要由唐功利课题组博士张玥和博士生温万红等人完成。这一工作得到国家自然科学基金委、上海市科委和中科院战略性先导科技专项等的大力资助。

最近,唐功利研究团队在该家族天然产物的自抗性机制研究方面再获新突破。该团队从YTM
研究材料出发,证明了 YtkR7(属于 GyrI-like 家族蛋白)可以水解 YTM
的环丙基,从而起到 YTM失活的目的。接下来他们揭示了 GyrI-like
家族的一个亚家族蛋白(截至 2016 年 9 月已有
1696条蛋白序列都来源于原核生物)具有水解 YTM 和 CC-1065
环丙基的特性,这也是
GyrI-like家族蛋白成员首次证明具有酶的活性(作者将这类酶定义为
cyclopropanoid cyclopropyl hydrolase, CCH)。

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